フアイアの免疫刺激性プロテオグリカン（TPG-1）は Toll 様受容体4 を介して NF-κB および MAPK シグナルを亢進する

Trametes robiniophila Murr.（フアイア）は、中国で古くから薬用素材として用いられてきたキノコであり、がんの治療において良好な臨床効果を示している。しかし、フアイアの抗腫瘍成分と、その根底にある分子機序はほとんど分かっていない。本研究では、フアイアの水抽出物から分子量約 5.59 × 10⁴ Da のプロテオグリカンを単離した。このプロテオグリカンを TPG-1 と名付け、FTIR およびその他の生化学的解析により、総炭水化物と総タンパク質の含有率がそれぞれ 43.9% および 41.2% であることを明らかにした。

生化学的アッセイと免疫ブロット法を用いて、マウス RAW264.7 マクロファージを TPG-1 に曝露すると、Toll 様受容体 4（TLR4）依存的な NF-κB およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナルの活性化を介して、一酸化窒素（NO）、腫瘍壊死因子 α（TNFα）、インターロイキン 6（IL-6）の産生が促進されることを見いだした。注目すべきことに、TPG-1 の投与は、ヌードマウスにおいてヒト肝がん HepG2 細胞の腫瘍形成を有意に抑制した。これは少なくとも一部には、血清 TNFα 濃度の上昇と、腫瘍への白血球浸潤の促進によるものと考えられる。TPG-1 は、肝がん H22 を移植したマウスでも良好な抗腫瘍活性を示し、これらのマウスに明らかな有害作用は見られなかった。

以上より、TPG-1 は TLR4–NF-κB/MAPK のシグナル系の活性化による免疫増強作用を通じて、部分的に抗腫瘍活性を発揮すると結論する。したがって TPG-1 は、がん免疫療法の有望な候補薬となりうる。本研究は、TPG-1 プロテオグリカンを抗腫瘍物質として同定し、その分子機序についての知見を提供するものであり、この物質をがん治療に応用できる可能性を示唆している。

Trametes robiniophila Murr.（フアイア）は、中国で 1600 年以上にわたり病気の治療に用いられてきた薬用真菌である。多くの研究が、フアイアが肝がん、胃がん、前立腺がん、結腸がん、乳がん、肺がんの治療において良好な臨床効果を示すことを報告している。フアイアの水抽出物に含まれる一部の多糖類が、抗腫瘍作用と免疫調節作用を示すという証拠がある。例えば、フアイアの粗多糖は AEG-1/EMT 経路を介して、ヒト肝細胞がん MHCC97-H 細胞の増殖と浸潤能を抑えた。フアイアの多糖 TP-1 は、少なくとも一部には HIF-1α／血管内皮増殖因子および AUF-1/AEG-1 のシグナル経路を不活性化することにより、肝細胞がんの増殖と転移を抑制した。また、フアイアの多糖 W-NTRP は、ヒト胆管がん細胞の生存率を低下させ、マウス脾細胞の増殖を促した。しかし、フアイアに含まれる抗腫瘍成分と、その根底にある分子機序はほとんど分かっていない。

抗腫瘍薬に対する反応において、免疫の増強はがん治療で重要な役割を果たす。近年、天然由来の多糖類・プロテオグリカンが、マクロファージなどの免疫エフェクター細胞を活性化することで腫瘍の増殖を抑えることが注目を集めており、免疫増強作用をもつ多糖類・プロテオグリカンから抗腫瘍薬を開発することは有望な戦略である。

本研究では、フアイアの水抽出物から分子量約 5.59 × 10⁴ Da のプロテオグリカン TPG-1 を単離した。TPG-1 で処理したマウスマクロファージ様 RAW264.7 細胞の培養上清が、ヒト肝がん HepG2 細胞および SK-HEP-1 細胞に対して顕著な細胞毒性を示すことを明らかにした。さらに TPG-1 は、マウスマクロファージ様 RAW264.7 細胞において、TLR4 依存的な NF-κB および MAPK シグナル経路の活性化を介して、NO、腫瘍壊死因子 α（TNFα）、インターロイキン 6（IL-6）の分泌を促進した。加えて、TPG-1 の投与はマウスにおいて HepG2 細胞または H22 細胞の腫瘍形成能を有意に弱めた。これは一部には、腫瘍への白血球の浸潤を促すことによると考えられる。

プロテオグリカン TPG-1 の単離・精製・性状解析

Huaier の水抽出物から、水抽出、除タンパク、エタノール沈殿によって糖画分（TS）を得た。この糖画分を DEAE セルロース（DE-52）カラムで水および 1.0 M NaCl 溶液により順に溶出し、pre-TPG-1 を単離した。水で溶出した pre-TPG-1 を Sepharose CL-6B カラムでさらに精製したところ、主要な画分は 1 つのみであり、これを TPG-1 と名付けた。この画分を回収し、凍結乾燥して以降の実験に用いた。

HPLC-GPC で検出したクロマトグラムは単一の対称なピークを示し（図 1A）、TPG-1 が均一であることを示唆した。TPG-1 の平均分子量は約 5.59 × 10⁴ Da と算出された。フェノール硫酸法で測定した TPG-1 の総炭水化物含有率は 43.93% であった。

図 1　プロテオグリカン TPG-1 の性状解析。A：フアイア由来プロテオグリカン TPG-1 の高速ゲル浸透クロマトグラフィー。B：TPG-1 の FTIR スペクトル。C：TPG-1 の UV スペクトル。D・E：MALDI-TOF-MS による TPG-1 の解析。F：TPG-1 の CD スペクトル。G：TPG-1 の微細構造の観察。

TPG-1 の FTIR スペクトルは、3408 cm⁻¹ 付近に強く幅の広い吸収ピークを示した。これはタンパク質の N–H 伸縮振動と多糖の水酸基に特徴的なものである。2921 cm⁻¹ および 2851 cm⁻¹ 付近の弱い吸収は、変角振動と C–H 伸縮振動によるものと考えられた。1651.61、1401.08、1261.74 cm⁻¹ の強い吸収ピークは、アシルアミノ基の C–O 伸縮振動と N–H 変角振動を含み、それぞれアミド I、II、III に帰属された。1043 cm⁻¹ の特徴的なバンドは、ピラノース環の O–H 変角振動によるものであった（図 1B）。

TPG-1 を 0.1 M NaOH で処理し、β 脱離を誘導した。β 脱離はトレオニン残基やセリン残基に結合した O 結合型糖鎖を選択的に遊離させる。NaOH により O 型糖鎖が遊離すると、セリンとトレオニンはアミノアクリル酸とアミノクロトン酸に変わり、240 nm の吸光度が増加する。結果は、TPG-1 に O 結合型糖鎖が存在しないことを示した（図 1C）。

PNGase F で処理した TPG-1 の分子量は MALDI-TOF-MS で低下しており、TPG-1 が N-グリコシド結合を含むことを示した。このことはさらに、TPG-1 が糖タンパク質であることを示唆した（図 1D・E）。

TPG-1 の単糖残基間の具体的なグリコシド結合を明らかにするため、メチル化分析を行った。GC-MS 分析における TPG-1 の個々のピークは、保持時間とマススペクトルとの比較によって同定した。表 1 にまとめたとおり、TPG-1 はグルコース（Glc）、キシロース（Xyl）、アラビノース（Ara）、ラムノース（Rha）、ガラクトース（Gal）、マンノース（Man）を含んでいた。結果から、2,4,6-Me₃-Glc、2,3,4-Me₃-Xyl、2,3,4-Me₃-Ara、2,4-Me₂-Rha、4-Me-Gal、4,6-Me₂-Man の 6 種類の結合型が、19.40：24.55：17.86：1.04：8.81：7.22 のモル比で存在することが示された。

表 1　TPG-1 のメチル化分析（表の内容は原著を参照）

さらにアミノ酸分析により、TPG-1 の総アミノ酸含有率は 41.20% であった。TPG-1 には 17 種類のアミノ酸が含まれ、主要なアミノ酸はグルタミン酸（7.42%）で、次いでアスパラギン酸、グリシン、アルギニン、トレオニン、アラニン、プロリン、セリンの順であった。また、TPG-1 の総必須アミノ酸含有率は 9.93% であった。TPG-1 には、リシン、フェニルアラニン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、バリンの 6 種類の必須アミノ酸が含まれていた（表 2）。CD スペクトルにより TPG-1 の二次構造を調べたところ、TPG-1 は水溶液中でランダムコイル構造をとることが示された（図 1F）。

表 2　TPG-1 のアミノ酸組成（表の内容は原著を参照）

TPG-1 の微細構造を原子間力顕微鏡（AFM）で観察した。その結果、TPG-1 は凝集してランダムな鎖状構造から棒状の塊を形成し、水溶液中に均一に分散していた。直径は 200〜800 nm、高さは 0.8〜3.3 nm であった（図 1G）。

ヒト肝がん HepG2 細胞および SK-HEP-1 細胞の増殖に対する TPG-1 の in vitro での作用

まず、ヒト肝がん HepG2 細胞を、TPG-1 で処理した、または処理していない RAW264.7 細胞の培養上清、あるいは TPG-1 を含む、または含まない新しい完全培地で、異なる時間培養した。図 2A に示すとおり、TPG-1 は対照群と比べて HepG2 細胞の増殖を弱く抑制した。一方、TPG-1 で処理した RAW264.7 細胞の培養上清は、TPG-1 で処理していない RAW264.7 細胞の培養上清と比べて、HepG2 細胞に対して時間依存的に顕著な細胞毒性を示した。ヒト肝がん SK-HEP-1 細胞でも同様の結果が得られた（図 2B）。この現象は、TPG-1 によって誘導された RAW264.7 細胞からの分泌因子によるものではないかと推測した。

図 2　TPG-1 で処理した RAW264.7 細胞の培養上清による、ヒト肝がん HepG2 細胞および SK-HEP-1 細胞への細胞毒性。HepG2 細胞（A）または SK-HEP-1 細胞（B）を、100 μg/mL の TPG-1 で 24 時間処理した、または処理していない RAW264.7 細胞の培養上清、あるいは 100 μg/mL の TPG-1 を含む、または含まない新しい完全培地で、それぞれ 24、48、72 時間培養した。細胞生存率は MTT アッセイで測定した。データは 3 回の独立した実験の代表であり、各実験は少なくとも 3 回ずつ行った。*：p < 0.05、**：p < 0.01、***：p < 0.001。エラーバーは信頼区間。

RAW264.7 細胞の NO 産生に対する TPG-1 の作用

NO は免疫応答において最も多様な働きをもつ物質の 1 つである。RAW264.7 細胞による NO 産生に対する TPG-1 の作用を調べた。TPG-1 は 24 時間の処理では 250 μg/mL の濃度まで RAW264.7 細胞に細胞毒性を示さなかった。ただし、処理時間を延ばすと、TPG-1 は RAW264.7 細胞の増殖を弱く抑制した（図 3A）。RAW264.7 細胞による NO 産生は TPG-1 の処理によって有意に刺激されたが、用量依存的ではなかった（図 3B）。対照群（4.85 ± 0.34 μM）と比べ、RAW264.7 細胞の培養上清中の NO 濃度は、TPG-1 50、100、250、500 μg/mL の処理により、それぞれ 22.63 ± 0.45、23.09 ± 0.49、23.54 ± 0.52、23.93 ± 1.18 μM へと大きく増加した。機序として、TPG-1 が RAW264.7 細胞において誘導型一酸化窒素合成酵素（iNOS）の mRNA とタンパク質の量を増加させることが明らかになった（図 3C・D）。

図 3　RAW264.7 細胞の NO 産生と iNOS 活性に対する TPG-1 の作用。A：RAW264.7 細胞を 0〜500 μg/mL の TPG-1（0、50、100、250、500 μg/mL）でそれぞれ 24、48、72 時間処理した。細胞生存率は MTT アッセイで測定した。B：0〜500 μg/mL の TPG-1 で 24 時間処理した RAW264.7 細胞が産生した NO の量をグリース反応で調べた。C・D：0〜500 μg/mL の TPG-1 で 24 時間処理した RAW264.7 細胞から全 RNA と細胞溶解液を抽出し、それぞれ定量的リアルタイム PCR（C）と免疫ブロット法（D）に供した。データは 3 回の独立した実験の代表であり、各実験は少なくとも 3 回ずつ行った。*：p < 0.05、**：p < 0.01、***：p < 0.001。エラーバーは信頼区間。

TPG-1 は RAW264.7 細胞において TNFα、IL-6、COX-2 の発現を増加させた

TPG-1 の免疫学的活性をさらに調べるため、TPG-1 に曝露した RAW264.7 細胞における TNFα と IL-6 の発現と分泌を、定量的リアルタイム PCR（qRT-PCR）と ELISA で調べた。TPG-1 の処理は RAW264.7 細胞の TNFα の mRNA 量を有意に増加させ（図 4A）、TNFα の分泌も TPG-1 の処理後に用量依存的に増加した（図 4B）。さらに TPG-1 は、RAW264.7 細胞における IL-6 の発現と分泌を大きく高めた（図 4C・D）。シクロオキシゲナーゼ 2（COX-2）は、活性化したマクロファージが放出する免疫因子の 1 つである。図 4（E・F）に示すとおり、TPG-1 の処理は RAW264.7 細胞における COX-2 の mRNA とタンパク質の量を増加させた。

図 4　RAW264.7 細胞における TNFα、IL-6、COX-2 の発現に対する TPG-1 の作用。A・C・E：0〜500 μg/mL の TPG-1 で 24 時間処理した RAW264.7 細胞から全 RNA を抽出し、定量的リアルタイム PCR に供した。B・D：0〜250 μg/mL の TPG-1 で 24 時間処理した RAW264.7 細胞の培養上清中の TNFα（B）または IL-6（D）の量を ELISA で測定した。F：0〜500 μg/mL の TPG-1 で 24 時間処理した RAW264.7 細胞から細胞溶解液を抽出し、免疫ブロット法に供した。データは 3 回の独立した実験の代表であり、各実験は少なくとも 3 回ずつ行った。**：p < 0.01、***：p < 0.001。エラーバーは信頼区間。

TPG-1 の処理は RAW264.7 細胞において TLR4 依存的に NF-κB および MAPK シグナル経路を活性化した

TPG-1 の免疫学的活性の根底にある機序を探るため、TPG-1 で処理した、または処理していない RAW264.7 細胞から全 RNA を抽出し、RNA-Seq を行った。図 5A に示すとおり、RNA-Seq データの解析から、Toll 様受容体シグナル経路、TNF シグナル経路、NF-κB シグナル経路を含む、TPG-1 によって変化した上位 30 の経路が示された。これらのシグナル経路は、免疫応答の調節に関与することが知られている。次に、RAW264.7 細胞の NF-κB シグナル経路に対する TPG-1 の作用を確かめるため、免疫ブロット解析を行った。TPG-1 は RAW264.7 細胞において IKKα/β、IκBα、p65 のリン酸化を増加させ、IKKβ の発現も増加させた（図 5B）。これは TPG-1 が NF-κB シグナル経路を活性化したことを示している。また、MAPK シグナル経路はマクロファージの活性化に関与することがしばしば報告されている。TPG-1 の処理は、RAW264.7 細胞における p38、ERK、JNK のリン酸化を著しく増加させた（図 5C）。したがって、TPG-1 による免疫増強は、RAW264.7 細胞における NF-κB および MAPK シグナル経路の活性化を介したものであることが示唆された。

図 5　TPG-1 の処理は RAW264.7 細胞において TLR4 依存的に NF-κB および MAPK シグナルを活性化した。A：TPG-1 で処理した、または処理していない RAW264.7 細胞から全 RNA を抽出して RNA シーケンスに供し、KEGG エンリッチメント解析による発現変動遺伝子の散布図（エンリッチされた上位 30 の KEGG 経路を含む）を示した。B・C：0〜500 μg/mL の TPG-1 で 48 時間処理した RAW264.7 細胞から細胞溶解液を抽出し、NF-κB シグナル経路または MAPK シグナル経路の各タンパク質について免疫ブロット法に供した。D・E：1 μM の TAK-242 の存在下または非存在下で、100 μg/mL の TPG-1 で 24 時間処理した、または処理していない RAW264.7 細胞から細胞溶解液を抽出し、免疫ブロット法に供した。データは 3 回の独立した実験の代表である。

RNA-Seq の結果は、Toll 様受容体シグナル経路が TPG-1 によって調節される主要な経路の 1 つであることを示した。また、Toll 様受容体 4（TLR4）が NF-κB および MAPK シグナルの活性化に不可欠であるという多くの証拠がある。そこで次に、TPG-1 による NF-κB および MAPK シグナル経路の活性化に TLR4 が関与しているかを調べた。図 5D に示すとおり、TPG-1 によって誘導された p-IKKα/β、IKKβ、p-p65、iNOS、COX-2 の発現増加は、RAW264.7 細胞において TLR4 阻害薬である TAK-242 の処理により明らかに抑制された。さらに、TPG-1 に曝露した RAW264.7 細胞における MAPK シグナルの亢進は、TAK-242 の処理により著しく減弱した（図 5E）。したがって、RAW264.7 細胞において TPG-1 が誘導する NF-κB と MAPK の活性化は TLR4 依存的であった。

TPG-1 が誘導する TNFα、IL-6、NO の増加は TLR4 を介していた

次に、RAW264.7 細胞において TPG-1 が誘導する TNFα、IL-6、NO の増加に TLR4 が関与しているかを調べた。TPG-1 が誘導した TNFα の分泌増加は、RAW264.7 細胞において TAK-242 の処理により有意に抑制された（図 6A）。TAK-242 の存在下または非存在下で TPG-1 処理した RAW264.7 細胞における IL-6 や NO の分泌でも、同様の結果が観察された（図 6B・C）。さらに、TPG-1 に曝露した RAW264.7 細胞における TNFα、IL-6、NO の増加に TLR4 が関与しているかを調べるため、RNAi を用いた。TLR4 を標的とする siRNA を導入した RAW264.7 細胞では TLR4 の発現が中程度に低下し（図 6D）、TLR4 の発現低下は RAW264.7 細胞の増殖に変化をもたらさなかった（図 6E）。一貫して、TLR4 の発現低下は、TPG-1 に曝露した RAW264.7 細胞における TNFα、IL-6、NO の分泌増加を減弱させた（図 6F–H）。総合すると、RAW264.7 細胞において TPG-1 の処理が誘導する TNFα、IL-6、NO の産生増加は TLR4 を介していた。

図 6　TPG-1 が誘導する TNFα、IL-6、NO の増加は TLR4 を介していた。A–C：1 μM の TAK-242 の存在下または非存在下で、100 μg/mL の TPG-1 で 24 時間処理した、または処理していない RAW264.7 細胞が産生した TNFα（A）、IL-6（B）、NO（C）の量を、ELISA またはグリース反応で測定した。D：TLR4 siRNA または陰性対照 siRNA を導入した RAW264.7 細胞から全 RNA を抽出し、定量的リアルタイム PCR に供した。E：TLR4 siRNA または陰性対照 siRNA を導入した RAW264.7 細胞の増殖を MTT アッセイで測定した。F–H：TLR4 siRNA または陰性対照 siRNA を導入した RAW264.7 細胞を 100 μg/mL の TPG-1 で 24 時間処理し、または処理せず、培養上清中の TNFα（F）、IL-6（G）、NO（H）の量を ELISA またはグリース反応で測定した。データは 3 回の独立した実験の代表であり、各実験は少なくとも 3 回ずつ行った。**：p < 0.01、***：p < 0.001。エラーバーは信頼区間。

TPG-1 の in vivo での抗腫瘍活性

腫瘍形成能の高いヒト肝がん HepG2 細胞を用いて異種移植腫瘍モデルを作製し、TPG-1 の in vivo での抗腫瘍効果を評価した。図 7A に示すとおり、TPG-1 の投与はヌードマウスにおける HepG2 細胞の腫瘍形成能を有意に弱めた。また、TPG-1 の投与はヌードマウスに有意な体重減少をもたらさなかった（図 7B）。さらに H&E 染色の解析から、TPG-1 は心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓を含む主要臓器に明らかな細胞毒性を示さなかった（図 7C）。加えて血液検査から、TPG-1 投与後のヌードマウスに血液毒性は認められなかった（図 7D–F）。TPG-1 の投与はヌードマウスの血清 TNFα 濃度も増加させた（図 7G）。図 7H に示すとおり、Ki67（増殖マーカー）、CD45（白血球マーカー）、F4/80（マクロファージマーカー）の免疫組織化学（IHC）解析から、TPG-1 の投与はヌードマウスにおいて HepG2 細胞の増殖を抑え、HepG2 細胞由来の腫瘍への白血球の浸潤を促したことが明らかになった。

図 7　TPG-1 は明らかな副作用なしに、in vivo での HepG2 細胞の腫瘍形成能を有意に抑制した。A：HepG2 異種移植腫瘍をもつヌードマウスに、TPG-1（腹腔内投与、60 mg/kg、1 日 1 回）または 5-FU（腹腔内投与、30 mg/kg、週 3 回）を投与した。B：薬剤投与中のヌードマウスの体重。C：TPG-1 を投与した、または投与していないヌードマウスの主要臓器の H&E 染色。スケールバー 50 μm。D–F：TPG-1 を投与した、または投与していないヌードマウスの白血球数、赤血球数、血小板数。G：TPG-1 を投与した、または投与していないヌードマウスの血清 TNFα 濃度を ELISA で測定した。H：TPG-1 を投与した、または投与していないヌードマウスの腫瘍組織の H&E 染色と免疫組織化学解析。スケールバー 50 μm（上）または 200 μm（下）。*：p < 0.05、**：p < 0.01、***：p < 0.001。エラーバーは信頼区間。

肝がん H22 を移植した昆明系マウスでも、TPG-1 の抗腫瘍効果を調べた。図 8A に示すとおり、TPG-1 の投与は昆明系マウスにおけるマウス肝がん H22 細胞の腫瘍形成能を有意に抑制した。体重曲線からは、TPG-1 の投与が昆明系マウスの体重を弱く抑えることが示された（図 8B）。また H&E 染色の解析から、TPG-1 は主要臓器に明らかな細胞毒性を示さなかった（図 8C）。加えて腫瘍組織の IHC 解析から、昆明系マウスにおける H22 細胞の増殖は TPG-1 によって抑えられ、TPG-1 の投与は昆明系マウスにおいて H22 細胞由来の腫瘍への白血球の浸潤も促したことが示された（図 8D）。総合すると、これらの結果は、TPG-1 の免疫増強作用が TPG-1 の抗腫瘍活性に寄与しているという考えを支持した。

図 8　TPG-1 は昆明系マウスにおけるマウス肝がん H22 細胞の腫瘍形成能を大きく抑制した。A：肝がん H22 を移植した昆明系マウスに、TPG-1（腹腔内投与、60 mg/kg、1 日 1 回）または 5-FU（腹腔内投与、30 mg/kg、週 3 回）を投与した。B：薬剤投与中の昆明系マウスの体重。C：TPG-1 を投与した、または投与していない昆明系マウスの主要臓器の H&E 染色。スケールバー 50 μm。D：TPG-1 を投与した、または投与していない昆明系マウスの腫瘍組織の H&E 染色と免疫組織化学解析。スケールバー 50 μm（左）または 200 μm（右）。**：p < 0.01、***：p < 0.001。エラーバーは信頼区間。

天然由来の多糖類・プロテオグリカンの抗がん作用は、近年ますます注目を集めている。本研究では、フアイアの水抽出物から新しいプロテオグリカン TPG-1 を単離した。さらなる検討により、TPG-1 は、TLR4 依存的な NF-κB および MAPK シグナル経路の活性化を介した免疫増強作用によって、部分的に良好な抗腫瘍活性を示すことが明らかになった。

マクロファージは免疫系の要となる細胞であり、NO、TNFα、IL-6 などのサイトカインを放出することで、腫瘍に対する防御に欠かせない役割を担っている。多くの多糖類・プロテオグリカンがマクロファージの活性化を促すことで免疫活性を高めるという証拠が多数ある。例えば、アッケシソウ（Salicornia）の多糖類は RAW264.7 細胞における NO 産生と iNOS の転写を有意に促進した。ブクリョウ（Poria cocos）から単離されたプロテオグリカンは、TNFα の増加を介して RAW264.7 細胞の活性化を誘導した。また、免疫調節作用がフアイアの抗腫瘍活性の根底にある機序の 1 つであることが報告されている。本研究では、フアイアから単離したプロテオグリカン TPG-1 が、RAW264.7 細胞における NO、TNFα、IL-6 の産生を有意に増加させることを示した。さらに TPG-1 の処理は、RAW264.7 細胞における iNOS と COX-2 の発現を大きく増加させた。NO の分泌はマクロファージの活性化によって増加し、腫瘍免疫療法においてがん細胞を殺す重要な因子である。また、iNOS の活性化はマクロファージにおける NO の産生増加をもたらす。TNFα と IL-6 はいずれも免疫応答に関わる多機能なサイトカインである。活性化したマクロファージが産生する TNFα は、腫瘍の壊死を誘導しうる。IL-6 は抗腫瘍活性をもつサイトカインであると報告されている。COX-2 は免疫応答において活性化されるシクロオキシゲナーゼである。TNFα はマクロファージにおける COX-2 の発現を高め、COX-2 は IL-6 の産生を正に調節する。したがって、COX-2 の増加は TPG-1 による IL-6 の増加に関与している可能性がある。総合すると、プロテオグリカン TPG-1 は強力な免疫賦活物質である。

多糖類による免疫増強の機序については、多くの報告がある。キバナオウギ（Astragalus）の多糖類は、マクロファージにおいて TLR4 シグナル経路の活性化を介して NO、TNFα、IL-6 の分泌を促進した。ヒジキ（Sargassum fusiforme）の多糖類は、マクロファージにおいて部分的に TLRs/NF-κB シグナル経路を介してサイトカインの産生を誘導した。Ganoderma atrum の多糖類（PSG-1）は、TLR4 を介した ROS／ホスファチジルイノシトール 3-キナーゼ／AKT、ROS/MAPK、ROS/NF-κB のシグナル経路の亢進を通じて、TNFα の分泌を促進した。TLR4 は自然免疫応答とサイトカイン産生において重要な役割を果たす。キキョウ（Platycodon grandiflorum）や P. cocos 由来の多糖類・プロテオグリカンの存在下でのマクロファージの活性化には、TLR4 が不可欠であると報告されている。多くの研究が、NF-κB と MAPK のシグナルの活性化が TLR4 を介していることを示している。さらに、NF-κB と MAPK のシグナル経路はいずれも、TNFα、IL-6、NO の分泌、ならびに iNOS と COX-2 の発現を正に調節する。本研究では、RAW264.7 細胞において TPG-1 が誘導する NF-κB および MAPK シグナル経路の活性化に TLR4 が必要であることを示した。さらに、薬理学的手法と遺伝学的手法の両方により、TPG-1 が誘導する TNFα、IL-6、NO の増加が TLR4 を介していることを明らかにした。したがって、TPG-1 は TLR4–NF-κB/MAPK のシグナル系の亢進を通じて良好な免疫増強作用を発揮すると考えられる。

多糖類・プロテオグリカンなど、がん免疫療法のための薬剤の研究はますます注目を集めている。現在、レンチナン、クレスチン（PSK）、シゾフィランなど、いくつかの抗腫瘍性の多糖類・プロテオグリカン製剤が市販され、あるいは臨床試験の段階にある。本研究では、TPG-1 の投与が異種移植マウスモデルにおいてヒト肝がん HepG2 細胞の腫瘍形成能を有意に抑制することを見いだした。また、TPG-1 投与後のマウスの体重、主要臓器、血液に明らかな副作用は見られなかった。TNFα は免疫応答やアポトーシスと密接に関わっている。TNFα はがん治療において良好な臨床効果を示すことが証明されている。本研究では、TPG-1 の投与がヌードマウスの血清 TNFα 濃度を増加させることを見いだしており、これが HepG2 細胞由来の腫瘍における細胞増殖の抑制に関与している可能性がある。加えて、TPG-1 で処理した RAW264.7 細胞の培養上清は、ヒト肝がん HepG2 細胞と SK-HEP-1 細胞に有意な細胞毒性を示した。興味深いことに、TPG-1 の投与はマウスにおいて腫瘍への白血球の浸潤を明らかに促した。さらに、肝がん H22 を移植した昆明系マウスでも、TPG-1 の同様の抗腫瘍効果が観察された。総合すると、TPG-1 は in vitro と in vivo の両方で免疫機能を増強できる。TPG-1 の抗腫瘍効果は、部分的に免疫増強によるものと考えられる。したがって、フアイア由来のプロテオグリカン TPG-1 は、がん免疫療法の有望な候補薬となりうる。

まとめると、フアイアから分子量約 5.59 × 10⁴ Da のプロテオグリカン TPG-1 を単離した。TPG-1 の総炭水化物含有率は 43.93% であり、グルコース、キシロース、アラビノース、ラムノース、ガラクトース、マンノースが 19.40：24.55：17.86：1.04：8.81：7.22 のモル比で構成されていた。TPG-1 のタンパク質含有率は 41.20% であり、N-グリコシド結合によって糖鎖と結合していた。さらに、TPG-1 が TLR4–NF-κB/MAPK のシグナル系の活性化を介した免疫増強作用によって、部分的に良好な抗腫瘍活性を発揮することを示した（図 9）。ただし、TPG-1 がフアイアの臨床効果に対する主要な成分であるかどうかは、なお不明である。TPG-1 はがん治療の新たな候補薬となりうる。本研究は TPG-1 の分子機序についての知見を提供し、この物質をがん免疫療法に応用できる可能性を示唆している。

図 9　フアイア由来プロテオグリカン TPG-1 の免疫増強作用の機序を示す模式図。TPG-1 は、TLR4 依存的な NF-κB および MAPK シグナル経路の活性化を介した TNFα、IL-6、NO の増加による免疫増強作用を通じて、部分的に抗腫瘍活性を発揮した。

試薬と抗体

DMEM、FBS、PBS、0.25% トリプシン-EDTA は Corning Life Sciences（米国ニューヨーク州コーニング）から入手した。TAK-242 は Aladdin Shanghai Biochemical Technology（中国上海）から入手した。5-FU は Sigma（ドイツ・ダイゼンホーフェン）、MTT は Biodee（中国北京）から入手した。iNOS（カタログ番号 13120）、COX-2（4842）、p-IKKα/β（2697）、IKKβ（8943）、p-IκBα（2859）、IκBα（4814）、p-p65（3033）、p65（8242）、p-p38（4511）、p38（8690）、p-ERK1/2（4370）、ERK1/2（4695）、p-JNK（4668）、JNK（9252）に対する抗体は Cell Signaling Technology（米国マサチューセッツ州ダンバース）から購入した。抗 β-アクチン抗体（sc-47778）と、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（sc-2005）または抗ウサギ抗体（sc-2004）は Santa Cruz Biotechnology（米国テキサス州ダラス）から入手した。

細胞培養

ヒト肝がん細胞株 SK-HEP-1 と HepG2 は American Type Culture Collection（米国バージニア州マナサス）から入手した。マウスマクロファージ様細胞株 RAW264.7 は、中国医学科学院基礎医学研究所 細胞培養センター（中国北京）から入手した。細胞は 10% FBS と 1% ペニシリン／ストレプトマイシンを含む DMEM で、37 °C、5% CO₂ の条件で維持した。

プロテオグリカン TPG-1 の単離と精製

Huaier（T. robiniophila Murr.）の膏剤（electuary ointment）は中国江蘇省の製薬企業から入手した［製造元の企業名は本会が省略］。フアイアの膏剤を蒸留水に溶かして 8% の希釈液とし、Sevage 試薬を加えて遊離タンパク質を除去した。60% エタノールで分離した沈殿を遠心分離（3000 × g、10 分）で回収して蒸留水に溶かし、真空凍結乾燥の前に減圧下で濃縮して余分な溶媒の残留物を除いた。TS を蒸留水に溶かし、その溶液を DEAE セルロース（DE-52）カラムに負荷し、蒸留水と 1.0 M NaCl で順に溶出した。1.0 M NaCl で溶出した画分を透析し、さらに Sepharose CL-6B カラムで蒸留水により流速 1 mL/分で溶出して分離・精製し、主要な 1 画分を得た。この画分は HPLC-GPC-ELSD で単一の対称なピークを示し、凍結乾燥して精製プロテオグリカンとし、TPG-1 と名付けた。

本会注：本文の「結果」では水で溶出した画分を精製したと記載され、「実験方法」では 1.0 M NaCl で溶出した画分を精製したと記載されている。原著の記載のとおりに訳した。

プロテオグリカン TPG-1 の性状解析：IR スペクトル分析

TPG-1 の FTIR スペクトルは、臭化カリウム（KBr）錠剤法により、FTIR 分光計（日本分光、東京）を用いて 400〜4000 cm⁻¹ の範囲で測定した。

グリコシド結合の分析

TPG-1 を 0.5 M NaBH₄、0.1 M NaOH に溶かし、25 °C で 18 時間インキュベートした。NaOH 処理をしていない TPG-1 を対照とした。NaOH 処理した試料と未処理の試料を、UV 分光光度計（日本分光）で 200〜400 nm の範囲で測定した。TPG-1 を炭酸水素アンモニウム（NH₄HCO₃、50 mM）に溶かし、グリコシダーゼ PNGase F（New England Biolabs）で 37 °C、16 時間処理した。加水分解反応は 95 °C で 10 分間加熱して停止した。分子量は MALDI-TOF-MS（AB Sciex 4700）で分析した。グリコシダーゼで加水分解していない TPG-1 を対照とした。

メチル化分析

TPG-1 の総炭水化物含有率の測定にはフェノール硫酸法を用いた。TPG-1 は、既報の方法に一部修正を加えて完全にメチル化した。TPG-1（7 mg）を乾燥メタノール 10 mL に溶かし、蒸発乾固した。乾燥した TPG-1 を DMSO（10 mL）に溶かし、NaOH（600 mg）と混合して 2.5 時間超音波処理した。遮光下でヨウ化メチル（500 μL）を反応混合物に加え、10 分間超音波処理した。この操作を 3 回繰り返し、混合物をさらに 1 時間超音波処理した。反応生成物に蒸留水 7 mL とクロロホルム 3 mL を加え、振とう混合した後に遠心分離した。クロロホルム層を蒸留水で 3 回洗浄した。続いて、FTIR で O–H バンド（3200〜3600 cm⁻¹）の消失によりメチル化の完了を確認した。完全にメチル化した試料を 2 M TFA 10 mL で 6 時間加水分解した。加水分解物を NaBH₄ 20 mg で還元して 40 °C で 30 分間保ち、氷酢酸 100 μL を加えて還元反応を停止した。生成物を減圧乾燥した後、無水酢酸 2 mL とピリジン 2 mL でアセチル化した。95 °C で 1 時間インキュベートした後、アセチル化誘導体を蒸発乾固し、クロロホルム 2 mL で抽出した。最後に、GC-MS（GCMS-QP 2010、島津製作所、京都）でアルジトールアセテートを分析した。

分子量の測定

プロテオグリカン TPG-1 の平均分子量は、TSK® G5000PWXL（300 × 7.8 mm）を用いた HPLC-GPC-ELSD により、脱イオン水で流速 0.8 mL/分で溶出して測定した。平均分子量は、デキストラン標準品（Sigma；1、12、50、80、270、670、1100 kDa）の保持時間との比較により算出した。

アミノ酸組成の分析

TPG-1 のアミノ酸組成は次のように測定した。TPG-1 15.55 mg を 6 M HCl 10 mL で 110 °C、24 時間加水分解した。試料 1 mL を取って乾燥させ、0.02 M HCl 500 μL を加えて溶かした。遠心分離（12,000 × g、10 分）後、上清をろ過し、L-8800 日立高速アミノ酸分析計（東京）でアミノ酸組成を分析した。

CD スペクトルの分析

TPG-1 を蒸留水に溶かし、CD 分光偏光計（Chirascan、Applied Photophysics、英国レザーヘッド）で 25 °C、190〜260 nm の範囲で測定した。

微細構造の観察

TPG-1 の超微細構造の観察には AFM（BioScope Catalyst NanoScope V、Bruker、米国マサチューセッツ州ビレリカ）を用いた。TPG-1 を蒸留水に溶かし（1 μg/mL）、室温で 6 時間撹拌した。この溶液 5 μL を劈開直後のマイカ基板に滴下し、室温で乾燥させた。AFM はコンタクトモードで測定した。チューブ型圧電スキャナー（5 × 5 μm）と Si₃N₄ プローブ（オリンパス、日本）を用いた。画像は 256 × 256 ピクセル、1 ラインあたり 1.0 Hz の走査速度で同時に取得した。

細胞生存率の測定

細胞を 96 ウェルプレートに 1 ウェルあたり 4000〜10,000 個の密度で播種した。翌日、示した濃度の TPG-1 で各時間処理した。その後、上清を除去し、各ウェルに MTT を終濃度 0.5 mg/mL で加えた。37 °C で 4 時間インキュベートした後、各ウェルに DMSO 150 μL を加え、マイクロプレートリーダー（PerkinElmer Life Sciences）で 490 nm の吸光度を測定した。

RNA シーケンスとデータ解析

TPG-1（100 μg/mL）で 24 時間処理した、または処理していない RAW264.7 細胞から、TRIzol（Invitrogen）を用いて製造元のプロトコルに従い全 RNA を抽出した。RNA シーケンスは Shanghai Biotechnology Corp.（中国上海）が Illumina HiSeq X Ten で行った。データ解析には Hisat2 と StringTie のソフトウェアを用いた。

qRT-PCR

示した濃度の TPG-1 で 24 時間処理した RAW264.7 細胞から TRIzol で全 RNA を抽出し、PrimeScript RT Reagent Kit（タカラバイオ、中国大連）を用いて製造元のプロトコルに従い cDNA に変換した。cDNA 4 μL を鋳型とし、TransStart Tip Green qPCR Kit（TransGen Biotech、中国北京）を用いて定量 PCR を行った。プライマー配列は次のとおりである。iNOS forward 5′-CGGCAAACATGACTTCAGGC-3′、iNOS reverse 5′-GCACATCAAAGCGGCCATAG-3′、TNFα forward 5′-CCCCTTTATTGTCTACTCCT-3′、TNFα reverse 5′-AAAGCCCATTTGAGTCCTTG-3′、IL-6 forward 5′-AAATAGTCCTTCCTACCCCAA-3′、IL-6 reverse 5′-CCGAGTAGATCTCAAAGTGAC-3′、COX-2 forward 5′-TCAATACTGGAAGCCGAGCA-3′、COX-2 reverse 5′-CACCCCTTCACATTATTGCAGA-3′、TLR4 forward 5′-CAAGGGATAAGAACGCTGAGA-3′、TLR4 reverse 5′-GCAATGTCTCTGGCAGGTGTA-3′、GAPDH forward 5′-GCGACTTCAACAGCAACTCC-3′、GAPDH reverse 5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCGT-3′。

NO の測定

RAW264.7 細胞を 96 ウェルプレートに 1 ウェルあたり 80,000 個の密度で播種した。翌日、示した濃度の TPG-1 で 24 時間処理した。NO の量は、培養上清中の亜硝酸濃度を調べることで評価できる。亜硝酸の量は、一酸化窒素アッセイキット（Applygen、中国北京）を用いて製造元のプロトコルに従いグリース反応で測定した。

ELISA

RAW264.7 細胞を 6 ウェルプレートに播種した。翌日、示した濃度の TPG-1 で 24 時間処理した。培養上清を回収し、上清中に分泌された TNFα と IL-6 の量を、TNFα および IL-6 の ELISA キット（Boster、中国武漢）を用いて製造元の説明書に従い調べた。

免疫ブロット法

RAW264.7 細胞を冷 PBS で 2 回洗浄し、溶解緩衝液（10% グリセロール、10 mM Tris（pH 6.8）、2% SDS、100 mM DTT）を用いて氷上で回収し、98 °C で 10 分間煮沸した。タンパク質量は既報のとおり免疫ブロット解析で検出した。要約すると、細胞溶解液を SDS-PAGE で分離した後、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。続いて、膜を 3〜5% 脱脂粉乳を含む TBST で室温 1 時間ブロッキングし、一次抗体と 4 °C で一晩反応させた。次に、膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体と室温で 2 時間反応させ、化学発光で検出した。

RNAi

siRNA は GenePharma（中国上海）で合成した。6 ウェルプレートで培養した RAW264.7 細胞に、Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）を用いて製造元のプロトコルに従い siRNA を導入した。siRNA の配列は次のとおりである。TLR4（マウス）5′-GAAUUGUAUCGCCUUCUUATT-3′、陰性対照（スクランブル siRNA）5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。

TPG-1 の投与

ヌードマウス（BALB/c、4〜5 週齢）と昆明系マウス（4〜5 週齢）は、北京維通利華実験動物技術有限公司から入手した。皮下腫瘍モデルは既報のとおり作製した。HepG2 細胞 2 × 10⁶ 個またはマウス肝がん H22 細胞 8 × 10⁶ 個を 200 μL のダルベッコ改変イーグル培地に懸濁し、それぞれヌードマウスまたは昆明系マウスの右後背部に皮下接種した。マウスを無作為に 3 群に分け、腹腔内注射で薬剤を投与した。各群 6 匹とした。3 群は次のとおりである。(i) PBS、1 日 1 回、(ii) TPG-1 60 mg/kg、1 日 1 回、(iii) 5-FU 30 mg/kg、週 3 回。腫瘍の増大を測定し、初期体積で正規化した。動物実験は、北京中医薬大学倫理委員会が承認した動物の使用と管理に関する指針に従って行った。

血液検査

TPG-1 を投与した、または投与していないヌードマウスから血液試料を採取した。白血球数、赤血球数、血小板数を、シスメックス XS-800i 自動血球分析装置（神戸）で調べた。

IHC 解析

免疫組織化学染色は既報のとおり行った。要約すると、TPG-1 を投与した、または投与していないマウスの主要臓器または腫瘍組織を 4% パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。続いて、パラフィン切片を H&E 染色と各タンパク質の免疫組織化学解析に供した。

統計解析

2 群間の差の解析には両側スチューデントの t 検定を、多群の比較には二元配置分散分析を用いた。データ解析には GraphPad Prism バージョン 5.0 を用いた。すべての図のデータは平均値 ± 95% 信頼区間で示した。p < 0.05 を統計的に有意とした。

A. Y. と H. F. は実験を行い、データを解析し、原稿を執筆した。Yanan Zhao、X. Chen、Z. Z.、X. Z.、Yunfang Zhao は実験を行い、データを解析した。X. Chai と J. L. はデータを解析し、原稿を改訂した。P. T. と Z. H. は研究を着想し、実験を設計し、原稿を改訂した。すべての著者が最終原稿を読み、承認した。